毛虫による皮膚炎 （９）ヒトリガ蛋白に対する特異的IgE抗体検出法
毛虫による皮膚炎 （９）ヒトリガ蛋白に対する特異的IgE抗体検出法
これまでヒトリガの体液及びアレルギーの原因と思われる物質の分析は次の様に説明してきました。
「（６）ヒトリガ毛虫の体液分析」・・・毛虫５齢期の体液で、フタル酸ジイソオクチルとオクタン-1-オールが明らかにされました。
「（７）ヒトリガ蛹（さなぎ）の体液分析」・・・さなぎの生育段階からは、ヒスタミン、4-メチルヒスタミン、イミダゾール、2-メチル-5-プロパン-2-イルシクロヘキサ-2,5-ジエン-1,4-ジオン（揮発性物質）、オクタン-1-オール、1,4-ベンゼンジカルボン酸、ジメチルエステルが検出されました。
「（８）ヒトリガ体液のペプチド質量分析」・・・ ヒトリガ成虫の体液では、ペプチド（0.5〜1.4kDa）が７つ、蛾の排泄物中には、4.279kDaのペプチドが検出されました。
今回は、ヒトリガによってＩ型アレルギーを発症していた場合、血清中に現れるヒトリガ特異的ＩｇＥ抗体の検出法の原理についてご説明します。
タイトル：Population Explosions of Tiger Moth Lead to Lepidopterism Mimicking Infectious Fever Outbreaks
訳：「ヒトリガ（タイガー・モス）の大量発生は、感染性発熱の大流行を招く」
研究者：Pallara Janardhanan Wills, Mohan Anjana, Mohan Nitin, Raghuveeran Varun,他。
研究機関：MIMS Research Foundation, Malabar Institute of Medical Sciences (Aster MIMS), Kozhikode, Kerala, India
インドのケラーラ州にある医科学研究所。
ICFO-Institut de Ciències Fotòniques, Barcelona, Spain スペインのバルセロナにあるスペイン カステイダフェルスの研究機関
公表雑誌：PLoS One. 2016; 11(4): e0152787.
アレルギーの原因物質（タンパク質）が明らかにされていない状態での特異的IgE抗体証明の概略
ヒトリガに対する特異的ＩｇＥ抗体は、スギ花粉症のように簡単に調べる事ができません。
ところが、ヒトリガに対するアレルギー症状については、蛾（ガ）に含まれる原因物質がまだ明らかにされていません。
そこで下に示す手順の概略をご説明します。
１） ヒトリガの蛋白成分をゲル電気泳動により分けます。
但し、この時点で分けられたヒトリガの蛋白成分はゲル（寒天のようなもの）の中に留まっています。
２） そこで、分けられたヒトリガの蛋白質を膜の上に移します（転写します）。
３） 次に、膜状のヒトリガ蛋白質に患者血清を反応させ、特異的 ＩｇＥ抗体が存在すれば転写した膜の上で反応します。
４） 患者血清中にヒトリガに対する特異的ＩｇＥ抗体が反応していれば、抗ヒトＩｇＥ抗体にペルオキシダーゼを結合させたものを反応させ、ペルオキシダーゼ反応で発色させて証明します。
上記の原理を踏まえながら、もう具体的に以下にご説明させて頂きます。
方法６ ヒト血清中のヒトリガに特異的なIgE抗体の証明方法
下の図は、免疫ブロット法で、ヒトリガノ蛋白質を電気泳動により、荷電状態で分離後、患者血清を反応させ、患者血清中にヒトリガの蛋白質に対する特異的IgE抗体の存在を証明した結果です。
<ヒトリガ蛋白質の電気泳動と特異抗体の証明法の原理の説明>
（ａ）ヒトリガ蛋白質の電気泳動
１）ヒトリガの蛋白質をゲル電気泳動にかけることで、様々な分子量の蛋白質を分けることが出来ます。
２）分けられたヒトリガ蛋白質をタンパク質染色色素であるクーマシーブリリアントブルーで染色した結果が下の写真のB、C、Iの写真の青色の列で示されています。
３）電気泳動により、荷電状態と分子量によりBでは７～８０ｋDa（キロダルトン）の蛋白質が染まっています。
また、CとＩでは６～１０３ｋDaの蛋白質が染まっています。
（ｂ）転写の意味
電気泳動で分離したヒトリガの蛋白質をゲルの中からメンブレン（膜）の上に移す理由は、ゲル中の蛋白質は拡散しやすいこと、患者血清中の抗体がゲルの中に入るのに時間を要し、抗体の量も多く必要になるので、電圧をかけて膜の上に移動（転写）させます。
転写させることで、メンブレン（膜）上にヒトリガの蛋白質が固定され、抗体はメンブレン表面のタンパク質と反応しやすくなり、抗体量が少なくても短い反応時間で抗原抗体反応を終えられます。
（Ｃ）ヒトリガ特異的ＩｇＥ抗体の検出
１）下の写真のＢ，Ｃ，Ｉで青色に染まったヒトリガの蛋白質は、それぞれ転写されています。
２）転写された膜（メンブラン）に患者血清を反応させます。この時、患者血清中にヒトリガの蛋白質に対するＩｇＥ抗体があれば、膜状の蛋白質（抗原蛋白）と抗原抗体反応を起こします。つまり、次の様に現せます。
ヒトリガの蛋白質（抗原） ＋ 患者血清中に特異的ＩｇＥ抗体が存在する
→ ヒトリガの抗原蛋白質と血清中の特異的ＩｇＥ抗体が反応します。
３）上で反応後、洗浄してから、抗－ヒトIgE抗体（ペルオキシダーゼ）を反応させ、ペルオキシダーゼ反応でジアミノベンチジンを発色させた結果が下の図のB,C、K、Eの茶色の列です。
今回は、結果示しますが、その説明は次回とさせて頂きます。
